Tejeda Y, Fernandez JR, Colarte AB, Taylor CY

Idioma: Español
Referencias bibliográficas: 10
Paginas: 164-167
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RESUMEN

Un paso limitante en muchos análisis del proteoma a alto flujo es la clonación de losmarcos abiertos de lectura (ORF) en los vectores específicos para cada técnica. Por ejemplo, las metodologías para la detección de interacciones entre proteínas tales como el ensayo de dos híbridos de levadura (Y2H) requieren una validación utilizando métodos alternativos, como por ejemplo los ensayos de complementación de fragmentos de la proteína (PCA) o experimentos de precipitación de proteinas. Diversas alternativas experimentales para una rápida transferencia mediante la recombinación homóloga de genes in vivo entre los vectores Y2H y PCA fueron evaluadas. Dos juegos de cebadores universales con una superposición de homología entre 31 b de los insertos y los vectores aceptadores fueron diseñados y las condiciones de amplificación de la reacción de PCR fueron evaluadas. Los productos de PCR fueron cotransformados con el vector aceptor en cepas de E. coli que permiten la clonación mediante recombinación homóloga. El método demostró ser eficaz para la clonación de cinco ORFs con tamaños que oscilan entre 0.294 a 1.2 kb. El método propuesto permite la rápida transferencia de los marcos abiertos de lectura entre los vectores de los sistemas de Y2H y PCA mediante el uso de un conjunto universal de los cebadores. El método de clonaje no depende de la presencia de determinadas sitios de restricción en el vector aceptor y no provoca cambios en el marco abierto de lectura. Este sistema será útil para la validación de rutina de las interacciones de proteínas. También mostramos la viabilidad de la cepa DH10B para la clonación por recombinación homóloga.

REFERENCIAS (EN ESTE ARTÍCULO)

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