medigraphic.com
ISSN 1561-3054 (Digital)

2012, Número 3

<< Anterior Siguiente >>

Rev Cubana Med Trop 2012; 64 (3)


Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para la cuantificación del ADN del virus de la hepatitis B

Rodríguez LLA, Montalvo VMC, Sariego FS, Bello CM, Mora LE, Kourí CV, Martínez RPA, Sánchez WM, Marrero B

Idioma: Español
Referencias bibliográficas: 25
Paginas: 290-303
Archivo PDF: 190.74 Kb.


RESUMEN

Introducción: los niveles de ADN viral en muestras de suero son un marcador útil para monitorear la progresión de la enfermedad y la respuesta al tratamiento en pacientes con hepatitis B crónica; de ahí que se comercialicen estuches diagnósticos para esta función, con la desventaja de ser costosos.
Objetivos: desarrollar y evaluar el desempeño analítico de un sistema de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para la cuantificación del ADN del virus de la hepatitis B.
Métodos: se utilizaron cebadores que amplifican un fragmento del gen C y sonda de hidrólisis en el equipo LightCycler 1.5. Se construyó una curva estándar y se evaluó su eficiencia. Se utilizaron 272 muestras de suero para ensayos de especificidad analítica y clínica, especificidad y exactitud genotípica, coeficientes de variación intraensayo e interensayo, comparación con un estuche comercial y con la reacción en cadena de la polimerasa cualitativa para el virus de la hepatitis B.
Resultados: la curva estándar mostró excelente correlación lineal (r= -1) y valores muy bajos de error a lo largo de varias magnitudes de concentración de ADN diana. La especificidad analítica y clínica fue de 100 %, en tanto que al evaluar la especificidad y exactitud genotípica, se obtuvo que las diferencias entre los Log10 del valor obtenido y el de referencia eran inferiores a 0,5 Log10. El límite de detección por análisis de Probit se estimó en 16,41 UI/µL con un rango dinámico de cuantificación de hasta 108 UI/mL. El sistema mostró bajos coeficientes de variación intraensayo (0,16 a 1,45 %) e interensayo (0,9 a 2,62 %). La comparación con el estuche comercial artus HBV LC PCR kit mostró una correlación de r= 0,964 y r2= 0,929; con la reacción en cadena de la polimerasa cualitativa se confirmó la mayor sensibilidad y ventajas de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real.
Conclusiones: el ensayo cumple con los requisitos para la cuantificación del ADN del virus de la hepatitis B, que demuestra ser específico, sensible y reproducible. Su aplicación permitirá un mejor diagnóstico y seguimiento de los pacientes con hepatitis B crónica en Cuba.


REFERENCIAS (EN ESTE ARTÍCULO)

  1. Horvat RT, Tegtmeier GE. Hepatitis B and D viruses. In: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA, editors. Manual of Clinical Microbiology. 9th ed. vol. 2. Washington, DC: ASM Press; 2007. p. 1641-59.

  2. Yim HJ, Lok AS. Natural history of chronic hepatitis B virus infection: what we knew in 1981 and what we know in 2005. Hepatology. 2006;43:S173-81.

  3. Valsamakis A. Molecular testing in the diagnosis and management of chronic hepatitis B. Clin Microbiol Rev. 2007;20(3):426-39.

  4. Saldanha J, Gerlich W, Lelie N, Dawson P, Heermann K, Heath A. An international collaborative study to establish a World Health Organization international standard for hepatitis B virus DNA nucleic acid amplification techniques. Vox Sanguinis. 2001;80:63-71.

  5. Chevaliez S, Bouvier-Alias M, Laperche S, Hezode C, Pawlotsky JM. Performance of Version 2.0 of the Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan Real-Time PCR Assay for Hepatitis B Virus DNA Quantification. J Clin Microbiol. 2010;48(10):3641-7.

  6. Laperche S, Thibault V, Bouchardeau F, Alain S, Castelain S, Gassin M, et al. Expertise of Laboratories in viral load quantification, genotyping, and precore mutant determination for hepatitis B virus in a multicenter study. J Clin Microbiol. 2006;44(10):3600-7.

  7. Niesters HGM. Quantitation of viral load using real-time amplification techniques. Methods. 2001;25:419-29.

  8. Chen RW, Piiparinen H, Seppanen M, Koskela P, Sarna S, Lappalainen M. Real-Time PCR for detection and quantitation of hepatitis B virus DNA. J Med Virology. 2001;65:250-6.

  9. Sun S, Meng S, Zhang R, Zhang K, Wang L, Li J. Development of a new duplex real-time polymerase chain reaction assay for hepatitis B viral DNA detection. Virology J. 2011;8:227.

  10. Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. Molecular cloning: A laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory; 1982. p. 191-5.

  11. Carman WF, Jacyna MR, Hadziyannis S, Karayiannis P, McGarvey MJ, Makris A, et al. Mutation preventing formation of hepatitis B e antigen in patients with chronic hepatitis B infection. Lancet. 1989;2:588-91.

  12. Donald CR, Qureshi F, Malcolm J, Burns MJ, Holden MJ, Blasic JR, et al. An inter-platform repeatability study investigating real-time amplification of plasmid DNA. BMC Biotechnology. 2005;5:15.

  13. Ding C, Cantor CR. Quantitative analysis of nucleic acids-the last few years of progress. J Biochem Mol Biol. 2004;37(1):1-10.

  14. Ho SKN, Yam WC, Leung ETK, Wong LP, Leung JKH, Lai KN, et al. Rapid quantification of hepatitis B virus DNA by real-time PCR using fluorescent hybridization probes. J Med Microbiol. 2003;52:397-402.

  15. Mackay IM, Arden KE, Mitsche A. Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res. 2002;30(6):1292-305.

  16. Burns MJ, Nixon GJ, Foy CA, Harris N. Standardization of data from real-time quantitative PCR methods-evaluation of outliers and comparison of calibration curves. BMC Biotechnology. 2005;5:31.

  17. Gulley ML, Fan H, Elmore SH. Validation of Roche LightCycler Epstein-Barr virus quantification reagents in a clinical laboratory setting. J Mol Diagn. 2008;8(5):589-97.

  18. Jardi R, Rodriguez F, Buti M, Costa X, Cotrina M, Valdes A, et al. Quantitative detection of hepatitis B virus DNA in serum by a new rapid real-time fluorescence PCR assay. J Viral Hepatitis. 2001;8:465-71.

  19. Sitnik R, Paes A, Mangueira CP, Pinho JRR. A real-time quantitative assay for hepatitis B DNA virus (HBV) developed to detect all HBV genotypes. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 2010;52(3):119-24.

  20. Mendy ME, Kaye S, van der Sande M, Rayco-Solon P, Waight PA, Shipton D, et al. Application of real-time PCR to quantify hepatitis B virus DNA in chronic carriers in The Gambia. Virology J. 2006;3:23.

  21. Paraskevis D, Beloukas A, Haida C, Katsoulidou A, Moschidis Z, Hatzitheodorou H, et al. Development of a new ultra sensitive real-time PCR assay (ultra sensitive RTQ-PCR) for the quantification of HBV-DNA. Virology. 2010;7:57.

  22. Hochberger S, Althof D, Gallegos de Schrott R, Nachbaur N, Rock H, Leying H. Fully automated quantitation of hepatitis B virus (HBV) DNA in human plasma by the COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan system. J Clin Virol. 2006;35:373-80.

  23. Poljak M, Marin IJ, Seme K, Brinovec V, Maticic M, Meglic- Volkar J, et al. Second-generation Hybrid capture test and Amplicor monitor test generate highly correlated hepatitis B virus DNA levels. J Virol Methods. 2001;97:165-9.

  24. Watzinger F, Ebner K, Lion T. Detection and monitoring of virus infection by Real-Time PCR. Molec Aspects Med. 2006;27(2-3):254-98.

  25. Germer JJ, Qutub MO, Mandrekar JN, Mitchell PS, Yao JD. Quantification of hepatitis B virus (HBV) DNA with a TaqMan HBV analyte-specific reagent following sample processing with the MagNA Pure LC instrument. J Clin Microbiol. 2006;44:1490-4.




2020     |     www.medigraphic.com