Díaz-Alonso C, Garrote-Santana H, Amor-Vigil AM, Suárez-González Y, González-Mugica RR

Idioma: Español
Referencias bibliográficas: 9
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RESUMEN

La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR, es una técnica de biología molecular cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ácido desoxirribonucleico (ADN). La PCR con transcripción inversa (RT-PCR) es una variante de la PCR convencional donde se utiliza ácido ribonucleico (ARN) como molde para sintetizar ADN complementario (ADNc), con el que posteriormente se realiza la PCR correspondiente. El ARN es un material susceptible a la degradación debido a la acción de las ribonucleasas. En general, se obtiene muy poca cantidad, por lo que cuantificarlo implica perder una parte apreciable del ARN. Los espectrofotómetros convencionales utilizan grandes volúmenes de muestra y aunque es posible realizar una dilución, se compromete la concentración que en ocasiones puede llegar a no ser detectable. Se estudió sangre medular de 10 pacientes con diferentes entidades hematológicas. El volumen del aspirado varió entre 5 y 8 mL. La extracción y purificación de ARN se realizó de forma manual. La cuantificación se realizó en un espectrofotómetro de volumen múltiple utilizando solo 2 µL de muestra. Se realizó lectura de densidad óptica a 260 y 280 nm, para medir ácidos nucleicos y proteínas, respectivamente. La integridad del ARN se analizó mediante electroforesis horizontal en gel de agarosa al 2 % con bromuro de etidio como marcador de fluorescencia. Las concentraciones variaron desde 444,4 a 2515,5 ng/µL. La razón de pureza varió entre 1,111 y 2,091. No se observó degradación total de ninguna de las muestras. Son múltiples los factores que pueden afectar el rendimiento y la preservación del ARN, por lo que el análisis integral de su cantidad y calidad se hacen imprescindibles para llevar a cabo la transcripción inversa y las posteriores PCRs, de manera exitosa.

REFERENCIAS (EN ESTE ARTÍCULO)

1. Bartlett JM, Stirling D. A short history of the polymerase chain reaction. Methods Mol Biol. 2003; 226: 3-6.

2. Coleman WB, Tsongalis GJ. Molecular diagnostics: for the clinical laboratorian. Human Press. 2006. 47-56 65-74.

3. Paul Moss. History and development of molecular biology. In: Molecular Hematology. 3rd ed. Wiley Blackwell. 2010; p. 360-9.

4. Owen CJ, Fitzgibbon J. The genetics of acute myeloid leukemias. In: Provan D, Gribben J, eds. Molecular Hematology. 3rd edition. London: Wiley-Blackwell. 2010, p. 42-50.

5. van Dongen JJ, Macintyre EA, Gabert JA, Delabesse E, Rossi V, Saglio G et al. Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Report of the BIOMED-1 Concerted Action: investigation of minimal residual disease in acute leukemia. Leukemia. 1999 Dec;13(12):1901-28.

6. Kaushansky K, Lichtman MA, Beutler E, Kipps TJ, Seligsohn U, Prchal JT. Acute myelogenous leukemia In: William´s Hematology. 8th ed. New York: McGraw-Hill; 2010.

7. Maniatis T, Sambrook J, Fritsch EF. Molecular cloning - a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Press. 1982

8. Patel JP, Gönen M, Figueroa ME, Fernández H, Sun Z, Racevskis J, et al. Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia. N Engl J Med. 2012 Mar 22; 366(12):1079-89.

9. Meyerson M, Gabriel S, Getz G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat Rev Genet. 2010 Oct; 11(10):685-96.