2022, Número 3
Análisis de la expresión proteica de pacientes con rechazo de trasplante renal
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Idioma: Español
Referencias bibliográficas: 38
Paginas: 81-90
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RESUMEN
Introducción: el trasplante renal es el único tratamiento que mejora la calidad de vida en los pacientes con enfermedad renal crónica, al cierre de 2021 en México se realizaron 1,971 trasplantes. Dentro de las principales complicaciones observadas después del trasplante encontramos infecciones, alteraciones asociadas a la inmunosupresión, recurrencia de enfermedad de base y el rechazo. La incidencia de rechazo reportada a nivel mundial oscila entre 12 y 14%. El diagnóstico de rechazo es histopatológico; sin embargo, no se han reportado marcadores moleculares que nos permitan sospechar el desarrollo de esta entidad antes de que se inicie el deterioro estructural del injerto. Los métodos actuales para monitorizar el rechazo en el injerto son la elevación de creatinina, la presencia de proteinuria y el desarrollo de anticuerpos antidonador específico (ADES). Una biopsia renal implica riesgo de hematuria y hematoma perirrenal (2 a 4%). Antecedentes: existe una gran cantidad de biomarcadores nuevos, no invasivos en muestras de orina y de sangre periférica que se encuentran en investigación durante los últimos años, la mayoría de ellos con valor pronóstico o diagnóstico, así como diferentes grados de éxito clínico y preclínico. Algunos de ellos con relación al rechazo agudo, se han investigado miR146a-5p en suero del receptor y orina panel de tres genes (estudio CTOT 03 para rechazo celular mediado por células T (TCMR), el estudio KALIBRE (panel de 7 genes para TCMR) estudio GoCAR (panel de 17 genes para TCMR) kSORT (estudio AART), para rechazo mediado por células T y rechazo mediado por anticuerpos, fragmentos de complemento para rechazo mediado por anticuerpos, CXCL 9 para TCMR y ABMR CSCL 10, para ABMR por mencionar algunos de los trabajos que hasta el momento se han realizado. El desarrollo de nuevas tecnologías para identificar proteínas asociadas a un proceso metabólico ha demostrado la posibilidad de tener un impacto favorable en identificar procesos tales como el rechazo del injerto trasplantado. La proteómica consiste en una serie de técnicas bioquímicas y analíticas para identificar proteínas diferencialmente expresadas que podrían ser utilizadas como biomarcadores para este fin. Material y métodos: se incluyeron 23 pacientes trasplantados de riñón del Centro Médico Nacional 20 de Noviembre, sometidos a biopsia de injerto renal en un periodo de cuatro meses, los cuales se clasificaron en dos grupos, un grupo con función estable del injerto n = 13 y un grupo con rechazo activo mediado por anticuerpos n = 13. Se realizó análisis demográfico con moda, mediana y rangos sin encontrar diferencias significativas en ambos grupos. Las muestras de suero de los pacientes fueron analizadas en cuanto a su integridad, una vez que fueron cuantificadas por el método colorimétrico 2D-Quant, se eligieron las muestras más representativas por su contenido proteico, es decir, aquéllas cuya concentración proteica se encontraba por arriba de 20 mg/dL. Posteriormente, éstas se sometieron al análisis de separación electroforética de geles bidimensionales con la finalidad de identificar proteínas diferenciales en ambos grupos de estudio. Resultados: se sistematizó la toma, preservación y transporte de muestras de pacientes trasplantados de riñón del hospital 20 de Noviembre. Se estandarizó la cuantificación de proteínas para realizar análisis con geles bidimensionales y se realizó un análisis preliminar de patrones diferenciales de expresión, sentando los precedentes para los posteriores análisis y la identificación de las proteínas diferenciales por espectrometría de masas. Comparando ambos geles, encontramos la representación de proteínas de alta abundancia como inmunoglobulina, haptoglobina, factores de complemento, alfa 1 antitripsina, por mencionar algunas que resultan de mayor representación en los geles y denotan la adecuada preservación y manejo de los tejidos, llama la atención moléculas como CXC 7 y proteína ABMP, con mayor representación en el gel maestro de los pacientes con rechazo. Conclusiones: la proteómica clásica en el estudio de proteínas diferenciales para el desarrollo de protocolos para el descubrimiento de proteínas en pacientes que reciben un trasplante, con la finalidad de identificar potenciales marcadores moleculares que pudieran ser útiles para el diagnóstico de rechazo es una herramienta útil que se encuentra en desarrollo, requiere de tiempo y análisis de datos específicos para lograr resultados objetivos y trascendentales. Proteínas como CXC 7 y proteína ABMP resultan representativas para este estudio, y que deberán realizarse estudios de validación además de la identificación con espectrometría de masas para valorar la posibilidad de identificar proteínas diferentes a las reportadas en la literatura.INTRODUCCIóN
El trasplante renal es el único tratamiento que mejora la calidad de vida en los pacientes con enfermedad renal crónica en fase terminal, al cierre de 2019 en México se realizaron 2,987 trasplantes de riñón, la pandemia por COVID-19 afectó esta cifra para 2020 habiéndose realizado 915 trasplantes de riñón en el país; sin embargo, para el año 2021 se realizaron 1,971 trasplantes, esto en el contexto del plan de reactivación de programas de trasplante por parte del Centro Nacional de Trasplantes. Hoy en día, existen más de 17,020 pacientes con enfermedad renal crónica en espera de un trasplante renal.
Dentro de las principales complicaciones observadas después del trasplante encontramos infecciones, alteraciones asociadas a la inmunosupresión, recurrencia de enfermedad de base y el rechazo. La incidencia de rechazo reportada a nivel mundial oscila entre 12 y 14%. El diagnóstico de rechazo es histopatológico; sin embargo, no se han reportado marcadores moleculares que nos permitan sospechar del desarrollo de esta entidad antes de que se inicie el deterioro estructural del injerto. Los métodos actuales para monitorizar el rechazo en el injerto son la elevación de creatinina, la presencia de proteinuria y el desarrollo de anticuerpos antidonador específico (ADES).5 Una biopsia renal implica riesgo de hematuria y hematoma perirrenal (2 a 4%).
El desarrollo de nuevas tecnologías para identificar proteínas asociadas a un proceso metabólico ha demostrado la posibilidad de tener un impacto favorable en identificar procesos tales como el rechazo del injerto trasplantado.
El uso de las ciencias ómicas en el área de trasplante se ha convertido en una herramienta útil para el descubrimiento de nuevos biomarcadores con valor diagnóstico y pronóstico de ciertas patologías, así como para desarrollar tratamientos farmacológicos.
La proteómica se encarga del análisis de proteínas expresadas por el genoma completo, siendo un estudio dinámico de la expresión de procesos metabólicos en una determinada ruta de metabolismo, en este caso, echaremos mano de esta tecnología para descubrir moléculas con potencial valor biológico que permitan diagnosticar la evolución hacia un rechazo inmunológico en los pacientes con trasplante renal.
MATERIAL Y MéTODOS
Estudio exploratorio, prospectivo, observacional, transversal y comparativo en un periodo de cuatro meses en Centro Médico Nacional 20 de Noviembre, que incluyó 23 pacientes, dividiendo al grupo control en pacientes de 18 años o más con trasplante renal y función estable del injerto por al menos tres meses previos a la toma de biopsia. El grupo de estudio fueron pacientes de 18 años o más con trasplante renal y que se hayan sometido a biopsia de injerto renal por disfunción aguda del injerto. Se tomaron muestras simultáneas de sangre para extraer el suero, manteniéndolo en ultracongelación a -70 oC, para posteriormente someter las muestras a cuantificación de proteínas mediante el método 2D Want (colorimétrico), eligiendo cinco muestras con mayor concentración proteica de cada grupo (20 mg/dL), y se formó un pool de muestras. Estos pools se sometieron a separación elecroforética en geles de acrilamida de gradiente (ph4-7), y se tiñeron con colorante azul para posteriormente someterlos a biofotografía y análisis visual, correlacionando con base de datos Swiss 2DPAGE proteínas de suero.
RESULTADOS
De los pacientes sometidos a biopsia protocolaria (n = 26) en un periodo de cuatro meses, obtuvimos plasma a través de la toma de muestra por punción. Se excluyeron tres pacientes por no contar con expediente completo o no tener resultado de biopsia al momento del análisis. De los 23 pacientes restantes dividimos los grupos de estudio en un grupo control en los que la muestra del injerto demostró no tener cambios sugerentes de rechazo, y, por el contrario evolucionaron de manera estable hasta el momento del estudio (n = 8), el grupo de casos (n = 15) presentó de manera característica datos que sugieren rechazo activo mediado por anticuerpos. El análisis estadístico se realizó con SPSS versión 25 y STATA 14.0.
La mediana de edad para ambos grupos fue de 48 años con un rango de 17 a 72 años. La distribución en cuanto al sexo fue de dos mujeres y seis hombres para el grupo control y seis mujeres y nueve hombres en el grupo de casos. El origen del trasplante en el grupo control fueron de donante cadavérico, uno de donante vivo relacionado y un paciente recibió un injerto de donante vivo no relacionado, mientras que en el grupo con rechazo siete recibieron un trasplante renal de donante vivo relacionado, dos recibieron un trasplante renal de donante vivo no relacionado y seis pacientes recibieron un trasplante de donante cadavérico.
En cuanto a las condiciones generales de los casos, en el índice de masa corporal encontramos una mediana de 25.9 para el grupo control y 23.7 para el grupo con rechazo (p = 0.8) sin diferencia significativa en ambos grupos, para la creatinina sérica en ambos grupos encontramos una mediana de 1.4 mg/dL (rango 0.9-1.65) para el grupo con evolución estable del injerto y 1.29 (rango 0.9-1.7) para el grupo con rechazo (p = 0.9). La etiología reportada como causante de enfermedad renal crónica para este grupo incluye nefropatía diabética, lesión renal aguda, enfermedad renal poliquística y nefropatía por IgA, y cuatro de los ocho pacientes no contaban con diagnóstico etiológico de la enfermedad renal crónica, el riesgo pretrasplante para CMV en este grupo fue alto en cuatro pacientes e intermedio en otros cuatro. Como terapia de inducción a la inmunosupresión en el grupo control se utilizó timoglobulina en tres pacientes, basiliximab en cuatro pacientes y en un paciente no se especificó qué terapia fue la elegida.
Por otro lado, para el grupo con rechazo la etiología para desarrollar enfermedad renal resultó diversa al igual que en el grupo anterior teniendo como diagnósticos hipoplasia renal, preeclampsia, nefritis tubulointersticial y nefropatía por IgA, con nueve pacientes sin diagnóstico etiológico previo al trasplante, el riesgo de CMV fue alto en seis pacientes, intermedio en seis y bajo en tres. La terapéutica empleada como terapia de inducción en cuatro pacientes fue con timoglobulina, ocho con basiliximab y en tres pacientes no fue especificado en el expediente, una vez comparados ambos grupos, se realizó un análisis de diferencia de medias para ambos grupos, encontrando que no existe diferencia significativa en ambos grupos en cuanto al rango de creatinina al momento de la biopsia o al índice de masa corporal (Tabla 1).
En todas las muestras se realizó cuantificación de proteína por el método 2-D-Quant, cuya curva se muestra en la Figura 1.
EL kit 2-D Quant está diseñado para determinación precisa de la concentración de proteínas de muestras que serán analizadas por técnicas electroforéticas de alta resolución, tales como electroforesis 2D, SDS-PAGE o IEF. Muchos de los reactivos utilizados en la preparación de las muestras, incluyendo detergentes, reductores, caotrópicos y anfolitas son incompatibles con otros métodos de cuantificación.
En este ensayo se trabaja con la precipitación cuantitativa de las proteínas. Está basado en la unión específica de los iones de cobre a las proteínas. Las proteínas precipitadas son resuspendidas en una solución que contiene cobre, el cobre libre (no unido a proteínas) es medido a través de una reacción colorimétrica por lo que la densidad del color es inversamente proporcional a la concentración de proteína. El ensayo tiene una respuesta lineal en un rango de 0-50 μg de proteína.
Una vez realizado este procedimiento, se seleccionaron las cinco muestras de pacientes con mejor representación en cuanto a concentración proteica para tener resultados óptimos, dado que el análisis demográfico no arrojó diferencias significativas en cuanto a los grupos a estudiar.
En la Tabla 2 se describen las características histopatológicas de las biopsias obtenidas de los injertos renales. Se representa el número total de muestras obtenidas de pacientes que recibieron un trasplante renal, y se describe el diagnóstico histopatológico mediante el uso del puntaje de Banff, con lo que posteriormente se realizó la división de dos grupos de estudio, teniendo en cuenta a los casos con evolución estable del injerto y aquéllos con rechazo agudo, mediados por anticuerpos.
Una vez obtenidos estos resultados y habiendo elegido el número de muestra a estudiar se separaron en un concentrado de muestras con la intención de realizar un gel maestro. A continuación se describen las características de las biopsias de cada grupo, y las que se eligieron para el gel maestro.
De esta manera, en la Tabla 3 se concentran los pacientes con diagnóstico histopatológico de evolución estable del injerto, es decir, que no presentan datos de rechazo activo de mediado por anticuerpos, considerando las muestras identificadas con el número 3, 6, 8, 9, 12 y 14 para el análisis comparativo y la elaboración de un pool de muestras toda vez que la concentración proteica de estas muestras se observó por dentro del estándar de concentración de 20 μg por μL para obtener el análisis proteico completo.
En la Tabla 4 observamos, por otro lado, el número de muestras de pacientes con diagnóstico de rechazo agudo mediado por anticuerpos, tomando en consideración las muestras 4, 5, 7, 10 y 11, las cuales presentan una concentración optima (20 μg/μL) de proteínas para formar el pool de muestras y comparar con el pool de pacientes con evolución estable del injerto.
Las muestras representativas se resaltan en las Tablas 3 y 4. Se sometieron las muestras de plasma y suero a un análisis de integridad proteica, encontrando que las muestras obtenidas de los pacientes contenían un promedio de 77 μg de proteínas por μL de muestra obtenida, este análisis se realizó mediante el método 2D Quant, para cuantificación de proteínas. Una vez obtenido este resultado de la concentración de proteínas por muestra, se eligieron una vez más las muestras con mayor contenido proteico y que presentarán datos demográficos, clínicos e histopatológicos similares, esto con el objetivo de realizar un análisis dividido en dos grupos (casos y controles), con el objetivo de identificar proteínas diferenciales, que pudieran tener un significado analítico como potenciales marcadores moleculares.
El resultante de estas técnicas se muestra en las Figuras 2 y 3, teniendo como resultado integridad de proteínas mediante métodos electroforéticos.
En la Figura 2 se observa un gel de una dimensión en el que se determina la integridad proteica para el grupo control, observando en el carril 1 el marcador de peso molecular, y en el carril 1 al 8 las muestras representativas del grupo control.
En este experimento se realizó una nueva corrida para el grupo con rechazo (Figura 3), en donde el carril sin etiqueta representa el marcador de peso molecular y del carril 1 al 8 las muestras elegidas para este grupo.
En la Figura 4 se observa el patrón de separación electroforético en dos dimensiones del pool de muestras control, lográndose observar enriquecimiento de proteínas de alta abundancia como haptoglobina (pM: 48kDa pI4.9), imnunoglobulina (pM: 48kDa pI 6.8) apolipoproteína (pM: 32 kDa, pI6.4), alfa 1 antitripsina (pM: 51kDa pI 4.5), por otro lado, y en relación con estudios previos, analizamos la posible asociación en función del peso molecular y punto isoeléctrico de proteínas como el factor 4 de complemento (pM: 10kDa pI: 5.91) el cual se identificó en el grupo de rechazo, mientras que no se observó en el grupo control, otra proteína de interés, la apolipoproteína A-I (pM: 22kDa, pI: 5.48) se observa en ambos geles y la glicoproteína alfa 2 rica en leucina (pM: 49kDa pI: 4.58). El factor I de complemento (pM: 37900kDa pI: 5.03) se puede identificar en el grupo control y no así en el grupo con rechazo.
Una de las proteínas que se observa de manera interesante en el grupo con rechazo y que además ha sido compatible con pacientes que presentan enfermedad renal y proteína tubular es la proteína AMBP, la cual no se identifica en el grupo control, pero se observa de manera representativa en el grupo con rechazo y proteinuria tubular (proteína AMBP pI: 4.86, pM: 32kDa), otra proteína de interés, la citosina CXC 7 (pI: 7.27 pM: 83), la cual ha sido descrita en estudios previos con muestras de orina, resulta también positiva en el gel del grupo con rechazo. En el análisis visual comparativo, también se observa factor I de complemento (pI: 5.03 y pM: 37900kDa) y factor IV de complemento (pI: 6.41, pM: 31kDa).
Con estos resultados (Figura 5), podemos observar que se ha seguido un patrón electroforético de separación adecuado, y que, al realizar un análisis visual, resulta representativo con lo reportado en la literatura y en las bases de datos de geles bidimensionales. Cabe destacar que llaman la atención proteínas como CXC 7 y la proteína AMBP2 en el grupo con rechazo, y que, aunque han sido descritas en estudios previos, podrían representar moléculas de estudio para estudios posteriores.
Para este trabajo, el análisis de espectrometría de masas, el cual resulta adecuado para el análisis de la identificación experimental, no se ha realizado; sin embargo, las proteínas representativas presentan un patrón identificable en resultados de muestras públicas.
DISCUSIóN
El trasplante renal es hoy en día el tratamiento preferido para la enfermedad renal crónica siendo éste el estándar de oro, el reto que la inmunología del trasplante representa para conservar el injerto renal es parte de la lucha diaria en la atención de los pacientes a pesar de las nuevas tecnologías en tema de inmunosupresión. En este estudio se busca abrir la puerta al desarrollo de nuevas formas de identificar, monitorizar y tratar a los pacientes trasplantados con la finalidad de evitar o prolongar el desarrollo de rechazo. El paciente con trasplante está sometido a intervenciones que pueden comprometer la integridad del trasplante; sin embargo, son indispensables para poder integrar un diagnóstico. Observamos que el desarrollo de trasplante es independiente de factores tales como la edad, sexo, uso de algún tipo de tratamiento de inducción a la inmunosupresión, al igual que el tratamiento de mantenimiento otorgado, tampoco encontramos diferencias significativas en el análisis de medias entre los casos con evolución estable del injerto y a los pacientes con diagnóstico de rechazo activo mediado por anticuerpos. Con este resultado, para las curvas de normalidad encontramos que no cumplen con los criterios y se decidió utilizar para el análisis estadístico mediana, moda y rango, sin encontrar significancia estadística para las variables demográficas, el análisis estadístico se realizó con SPSS versión 25 y STATA 14.0. Una vez obtenidos estos resultados, se tomaron las muestras de plasma de cinco casos de ambos grupos para realizar un análisis de proteínas mediante proteómica clásica.
Para este análisis, se realizaron pruebas de integridad de proteínas, en donde encontramos que el contenido proteico de cada grupo fue suficiente para el análisis en geles de una dimensión, esto con la finalidad de tener material proteico suficiente para realizar pruebas más específicas. Una vez analizadas las muestras en cuanto a su integridad, se decidió hacer un set de descubrimiento con el grupo de rechazo y un set de descubrimiento con el grupo sin rechazo, esto se realizó analizando las proteínas de ambos grupos en geles bidimensionales obteniendo resultados alentadores, pues pudimos observar que existen proteínas diferenciales en ambas muestras de los pacientes, que si bien no necesariamente son de bajo peso molecular, podrían fungir como marcadores moleculares en las etapas siguientes del análisis de muestras. Por mencionar dos en particular, y que corresponden a lo reportado en la literatura, la citocina proinflamatoria CXC 7 y la proteína AMBP, las cuales se intensifican el los casos que presentan datos histopatológicos de rechazo, otras proteínas de alta abundancia como inmunoglobulinas, haptogloginas, apolipoproteínas, alfa 1 antitripsina se representan en ambas poblaciones de estudio, lo que nos permite aseverar que las muestras tomadas, analizadas y cuantificadas son realmente representativas del tejido estudiado.2
Es importante reconocer que el proceso de búsqueda de biomarcadores es el resultado de la selección, transporte, procesamiento y análisis estricto y sistemático de las muestras obtenidas. Para esto se ha establecido una ruta precisa en cada una de las etapas, mediante la sistematización de los procesos, lo que permitirá replicar el análisis cuantas veces sea necesario sin tener pérdidas en ninguna de las etapas del estudio.
Como bien sabemos, éste es el paso inicial de un estudio de descubrimiento en el que, con la acumulación de más sujetos de estudio y el continuo análisis, se lograrán establecer las condiciones específicas para detectar patrones o moléculas proteicas que en un segundo momento deberán ser analizadas mediante cromatografía de masas de alto rendimiento acoplada a espectometría de masas. Proceso que indudablemente deberá realizarse una vez que hayamos obtenido resultados normales en las pruebas que se realizan actualmente y se analicen los resultados para la optimización de recursos.
CONCLUSIONES
Se requiere de un análisis por espectrometría de masas para identificar proteínas diferenciales; sin embargo, en este estudio podemos concluir que existen diferencias potenciales entre los grupos de estudio en cuanto a características proteicas. Este estudio corresponde a la fase inicial de un protocolo de búsqueda de biomarcadores moleculares, tomando en cuenta que la sistematización y estandarización de cada fase de este estudio nos acercará a obtener resultados alentadores.
REFERENCIAS (EN ESTE ARTÍCULO)
Van Baardwijk M, Cristoferi I, Ju J, Varol H, Minnee RC, Reinders MEJ et al. A decentralized kidney transplant biopsy classifier for transplant rejection developed using genes of the Banff-Human organ transplant panel. Front Immunol. 2022; 13: 841519. Available in: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2022.841519/full
AFILIACIONES
1 Cirugía de Trasplante, Centenario Hospital Miguel Hidalgo, Aguascalientes, Ags. Sección de Posgrado e Investigación de la Escuela Superior de Medicina del Instituto Politécnico Nacional y Alumno de posgrado en el Instituto Nacional de Medicina Genómica.
2 Sección de Posgrado e Investigación de la Escuela Superior de Medicina del Instituto Politécnico Nacional.
3 Subdirector de Investigación Básica. Instituto Nacional de Medicina Genómica, Ciudad de México.
4 Jefe de Departamento de Cirugía de Trasplante, Centro Médico Nacional 20 de Noviembre, Ciudad de México.
5 Jefe de División de Trasplante. Hospital Regional "Dr. Valentín Gómez Farías", Zapopan, Jal.
6 Jefe de Unidad de Trasplante. Hospital General de México "Dr. Eduardo Liceaga", Ciudad de México.
7 Jefe de Departamento de Nefrología de Trasplante. Centro Médico Nacional 20 de Noviembre, Ciudad de México.
8 Profesor adjunto. Hospital General "Manuel Gea González", Ciudad de México.
9 Fellow Cirugía de Trasplante. Hospital General de México "Dr. Eduardo Liceaga", Ciudad de México.
10 Profesor adjunto Nefrología de Trasplante. Centro Médico Nacional 20 de Noviembre, Ciudad de México.
CORRESPONDENCIA
Dr. Josué Israel Olivares-del Moral. E-mail: jiolivaresdelmoral@gmail.comRecibido: 15-Jul-2022. Aceptado: 04-Ago-2022