Hardy E, Quintana D, Pentón G, Abrahantes MC

Idioma: Ingles.
Referencias bibliográficas: 6
Paginas: 2301-2305
Archivo PDF: 417.14 Kb.

RESUMEN

La extrusión de fragmentos de gel, a través de una malla metálica con un tamaño promedio de ranura de 32 µm que se encuentra insertada en el fondo de una jeringuilla de 1 mL, es un método útil para aumentar la elución pasiva de proteínas. Este método de extrusión funciona mediante la fragmentación de geles en pedazos extremadamente pequeños, para maximizar el área superficial y minimizar la distancia promedio que cada molécula de proteína tiene que difundir. Sin embargo, el microextrusor de geles no es práctico cuando decenas de fragmentos de gel de 0.5-1.5 mm se deben procesar de manera simultánea, para recuperar miligramos de la proteína blanco. El proceso completo es largo, muy tedioso, laborioso y requiere de habilidades para la manipulación del instrumental. Estas desventajas también se manifiestan cuando un fragmento de gel más grueso (por ejemplo, de 6-12 mm) se debe procesar para la elución de las proteínas que contiene. En este trabajo proponemos la solución a este problema, mediante el remplazo del microextrusor de gel por un agitador de alta velocidad (Ultraturrax^®, Ika). La aplicabilidad y utilidad del nuevo procedimiento se demostró en la elución y la recuperación de milígramos de pertactinas (Prn) separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida. Los recobrados de elución totales fueron de un 67.6 % para la Prn de tipo 1 (6.5 mg) y 88.5 % para la Prn de tipo 2 (8.5 mg total). Como promedio, el recobrado del proceso fue de 78 ± 14.8 % de proteína. Como se deseaba, el nuevo procedimiento no varió ni la movilidad electroforética ni provocó la aparición de ningún producto de degradación visible en las muestras de proteínas purificadas, y estas fueron detectadas con el uso del anticuerpo monoclonal anti-Prn 1 (PeM19). En consecuencia, el nuevo protocolo es útil para el aislamiento a la escala de miligramos, de proteínas blanco separadas en geles gruesos de electroforesis.

REFERENCIAS (EN ESTE ARTÍCULO)

1. Seelert H, Krause F. Preparative isolation of protein complexes and other bioparticles by elution from polyacrylamide gels. Electrophoresis. 2008;29(12):2617-36.

2. Hardy E, Castellanos-Serra LR. “Reverse- staining” of biomolecules in electrophoresis gels: analytical and micropreparative applications. Anal Biochem. 2004;328(1):1-13.

3. Witkowski C, Harkins J. Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery. JoVE. 2009:34.

4. Quintana-Vázquez D, Coizeau E, Alvarez A, Delgado M, Cárdenas T, Ramos Y, et al. Recombinant hybrid proteins from pertactin type 1 and 2 of Bordetella pertussis are more immunogenic in mice than the original molecules. Biotecnol Apl. 2014;31(1):33-42.

5. Hijnen M, Mooi FR, van Gageldonk PG, Hoogerhout P, King AJ, Berbers GA. Epitope structure of the Bordetella pertussis protein P.69 pertactin, a major vaccine component and protective antigen. Infect Immun. 2004;72(7):3716-23.

6. Abrahantes-Perez MC, Reyes-Gonzalez J, Veliz Rios G, Bequet-Romero M, Gomez Riera R, Anais Gasmury C, et al. Cytotoxic proteins combined with prodigiosin obtained from Serratia marcescens have both broad and selective cytotoxic activity on tumor cells. J Chemother. 2006;18(2): 172-81.